class: center, middle, inverse, title-slide # A very short, sketchy, introduction to Bioconductor ### Abhijit Dasgupta ### BIOF 339 --- layout: true <div class="my-header"> <span>BIOF 339</span></div> --- ## Bioconductor Bioconductor provides tools for the analysis and comprehension of high-throughput genomic and biological data, using R. + 1823 packages + Covers the bioinformatic pipeline + Analysis [`GenomicRanges`, `Biostrings`, `GenomicAlignments`, `SummarizedExperiment`] + Annotation (species/platform specific, system) [`biomaRt`, `org.Hs.eg.db`, `GO.db`, `KEGG.db`] + Experiments [`TENxPBMCData`, `airway`, `ALL`] + Workflows [`rnaseqGene`, `TCGAWorkflow`] --- ## Bioconductor .center[Bioconductor v. 3.10 packages] .pull-left[   ] .pull-right[   ] --- ## Installing Bioconductor packages Bioconductor is a separate repository and system which uses R. So the process is a bit different than `install.packages`. The following works for R version 3.5 and higher. ```r install.packages("BiocManager") *BiocManager::install(c('Biobase','limma','hgu95av2.db','Biostrings')) ``` There are several packages that are often installed for each Bioconductor package, and some have functions that have the same name as one's you've used. So + Use `package::function` format for calling functions from non-Bioconductor packages --- ## Bioconductor basics ```r library(Biostrings) dna <- DNAStringSet(c("AACAT", "GGCGCCT")) reverseComplement(dna) ``` ``` #> A DNAStringSet instance of length 2 #> width seq #> [1] 5 ATGTT #> [2] 7 AGGCGCC ``` -- ```r library(Biostrings) data("phiX174Phage") phiX174Phage ``` ``` #> A DNAStringSet instance of length 6 #> width seq names #> [1] 5386 GAGTTTTATCGCTTCCATGACGC...ATGATTGGCGTATCCAACCTGCA Genbank #> [2] 5386 GAGTTTTATCGCTTCCATGACGC...ATGATTGGCGTATCCAACCTGCA RF70s #> [3] 5386 GAGTTTTATCGCTTCCATGACGC...ATGATTGGCGTATCCAACCTGCA SS78 #> [4] 5386 GAGTTTTATCGCTTCCATGACGC...ATGATTGGCGTATCCAACCTGCA Bull #> [5] 5386 GAGTTTTATCGCTTCCATGACGC...ATGATTGGCGTATCCAACCTGCA G97 #> [6] 5386 GAGTTTTATCGCTTCCATGACGC...ATGATTGGCGTATCCAACCTGCA NEB03 ``` --- ## Bioconductor basics ```r letterFrequency(phiX174Phage, 'GC', as.prob=TRUE) ``` ``` #> G|C #> [1,] 0.4476420 #> [2,] 0.4472707 #> [3,] 0.4472707 #> [4,] 0.4470850 #> [5,] 0.4472707 #> [6,] 0.4470850 ``` --- ## Bioconductor data structures + So far we've seen the `data.frame` or `tibble` be the unit of data storage + In Bioconductor, data are stored in **containers** which can contain many elements of data for an experiment - Actual quantitative results of experiments - Phenotype data - Genotype meta-data - Results of analysis + In Bioconductor workflows, the same container is updated with new elements, which can then be accessed using accessor functions --- ## An ExpressionSet ```r library(Biobase) data('sample.ExpressionSet') str(sample.ExpressionSet) ``` ``` #> Formal class 'ExpressionSet' [package "Biobase"] with 7 slots #> ..@ experimentData :Formal class 'MIAME' [package "Biobase"] with 13 slots #> .. .. ..@ name : chr "Pierre Fermat" #> .. .. ..@ lab : chr "Francis Galton Lab" #> .. .. ..@ contact : chr "pfermat@lab.not.exist" #> .. .. ..@ title : chr "Smoking-Cancer Experiment" #> .. .. ..@ abstract : chr "An example object of expression set (ExpressionSet) class" #> .. .. ..@ url : chr "www.lab.not.exist" #> .. .. ..@ pubMedIds : chr "" #> .. .. ..@ samples : list() #> .. .. ..@ hybridizations : list() #> .. .. ..@ normControls : list() #> .. .. ..@ preprocessing : list() #> .. .. ..@ other :List of 1 #> .. .. .. ..$ notes: chr "An example object of expression set (exprSet) class" #> .. .. ..@ .__classVersion__:Formal class 'Versions' [package "Biobase"] with 1 slot #> .. .. .. .. ..@ .Data:List of 2 #> .. .. .. .. .. ..$ : int [1:3] 1 0 0 #> .. .. .. .. .. ..$ : int [1:3] 1 1 0 #> ..@ assayData :<environment: 0x7ff99f745d58> #> ..@ phenoData :Formal class 'AnnotatedDataFrame' [package "Biobase"] with 4 slots #> .. .. ..@ varMetadata :'data.frame': 3 obs. of 1 variable: #> .. .. .. ..$ labelDescription: chr [1:3] "Female/Male" "Case/Control" "Testing Score" #> .. .. ..@ data :'data.frame': 26 obs. of 3 variables: #> .. .. .. ..$ sex : Factor w/ 2 levels "Female","Male": 1 2 2 2 1 2 2 2 1 2 ... #> .. .. .. ..$ type : Factor w/ 2 levels "Case","Control": 2 1 2 1 1 2 1 1 1 2 ... #> .. .. .. ..$ score: num [1:26] 0.75 0.4 0.73 0.42 0.93 0.22 0.96 0.79 0.37 0.63 ... #> .. .. ..@ dimLabels : chr [1:2] "sampleNames" "sampleColumns" #> .. .. ..@ .__classVersion__:Formal class 'Versions' [package "Biobase"] with 1 slot #> .. .. .. .. ..@ .Data:List of 1 #> .. .. .. .. .. ..$ : int [1:3] 1 1 0 #> ..@ featureData :Formal class 'AnnotatedDataFrame' [package "Biobase"] with 4 slots #> .. .. ..@ varMetadata :'data.frame': 0 obs. of 1 variable: #> .. .. .. ..$ labelDescription: chr(0) #> .. .. ..@ data :'data.frame': 500 obs. of 0 variables #> .. .. ..@ dimLabels : chr [1:2] "featureNames" "featureColumns" #> .. .. ..@ .__classVersion__:Formal class 'Versions' [package "Biobase"] with 1 slot #> .. .. .. .. ..@ .Data:List of 1 #> .. .. .. .. .. ..$ : int [1:3] 1 1 0 #> ..@ annotation : chr "hgu95av2" #> ..@ protocolData :Formal class 'AnnotatedDataFrame' [package "Biobase"] with 4 slots #> .. .. ..@ varMetadata :'data.frame': 0 obs. of 1 variable: #> .. .. .. ..$ labelDescription: chr(0) #> .. .. ..@ data :'data.frame': 26 obs. of 0 variables #> .. .. ..@ dimLabels : chr [1:2] "sampleNames" "sampleColumns" #> .. .. ..@ .__classVersion__:Formal class 'Versions' [package "Biobase"] with 1 slot #> .. .. .. .. ..@ .Data:List of 1 #> .. .. .. .. .. ..$ : int [1:3] 1 1 0 #> ..@ .__classVersion__:Formal class 'Versions' [package "Biobase"] with 1 slot #> .. .. ..@ .Data:List of 4 #> .. .. .. ..$ : int [1:3] 2 13 0 #> .. .. .. ..$ : int [1:3] 2 11 5 #> .. .. .. ..$ : int [1:3] 1 3 0 #> .. .. .. ..$ : int [1:3] 1 0 0 ``` --- ## An ExpressionSet These objects are based on a different R structure. Instead of extracting elements using `$`, this structure uses **slots** which are accessed using `@` ```r slotNames(sample.ExpressionSet) ``` ``` #> [1] "experimentData" "assayData" "phenoData" #> [4] "featureData" "annotation" "protocolData" #> [7] ".__classVersion__" ``` ```r sample.ExpressionSet@phenoData ``` ``` #> An object of class 'AnnotatedDataFrame' #> sampleNames: A B ... Z (26 total) #> varLabels: sex type score #> varMetadata: labelDescription ``` --- ## An ExpressionSet We almost never use `@`. Instead we use *accessor functions* to extract data ```r pData(sample.ExpressionSet) # Phenotype data ``` ``` #> sex type score #> A Female Control 0.75 #> B Male Case 0.40 #> C Male Control 0.73 #> D Male Case 0.42 #> E Female Case 0.93 #> F Male Control 0.22 #> G Male Case 0.96 #> H Male Case 0.79 #> I Female Case 0.37 #> J Male Control 0.63 #> K Male Case 0.26 #> L Female Control 0.36 #> M Male Case 0.41 #> N Male Case 0.80 #> O Female Case 0.10 #> P Female Control 0.41 #> Q Female Case 0.16 #> R Male Control 0.72 #> S Male Case 0.17 #> T Female Case 0.74 #> U Male Control 0.35 #> V Female Control 0.77 #> W Male Control 0.27 #> X Male Control 0.98 #> Y Female Case 0.94 #> Z Female Case 0.32 ``` --- ## An ExpressionSet We almost never use `@`. Instead we use *accessor functions* to extract data ```r head(exprs(sample.ExpressionSet)) # Expression data ``` ``` #> A B C D E F G #> AFFX-MurIL2_at 192.7420 85.75330 176.7570 135.5750 64.49390 76.3569 160.5050 #> AFFX-MurIL10_at 97.1370 126.19600 77.9216 93.3713 24.39860 85.5088 98.9086 #> AFFX-MurIL4_at 45.8192 8.83135 33.0632 28.7072 5.94492 28.2925 30.9694 #> AFFX-MurFAS_at 22.5445 3.60093 14.6883 12.3397 36.86630 11.2568 23.0034 #> AFFX-BioB-5_at 96.7875 30.43800 46.1271 70.9319 56.17440 42.6756 86.5156 #> AFFX-BioB-M_at 89.0730 25.84610 57.2033 69.9766 49.58220 26.1262 75.0083 #> H I J K L M N #> AFFX-MurIL2_at 65.9631 56.9039 135.60800 63.44320 78.2126 83.0943 89.3372 #> AFFX-MurIL10_at 81.6932 97.8015 90.48380 70.57330 94.5418 75.3455 68.5827 #> AFFX-MurIL4_at 14.7923 14.2399 34.48740 20.35210 14.1554 20.6251 15.9231 #> AFFX-MurFAS_at 16.2134 12.0375 4.54978 8.51782 27.2852 10.1616 20.2488 #> AFFX-BioB-5_at 30.7927 19.7183 46.35200 39.13260 41.7698 80.2197 36.4903 #> AFFX-BioB-M_at 42.3352 41.1207 91.53070 39.91360 49.8397 63.4794 24.7007 #> O P Q R S T U #> AFFX-MurIL2_at 91.0615 95.9377 179.8450 152.4670 180.83400 85.4146 157.98900 #> AFFX-MurIL10_at 87.4050 84.4581 87.6806 108.0320 134.26300 91.4031 -8.68811 #> AFFX-MurIL4_at 20.1579 27.8139 32.7911 33.5292 19.81720 20.4190 26.87200 #> AFFX-MurFAS_at 15.7849 14.3276 15.9488 14.6753 -7.91911 12.8875 11.91860 #> AFFX-BioB-5_at 36.4021 35.3054 58.6239 114.0620 93.44020 22.5168 48.64620 #> AFFX-BioB-M_at 47.4641 47.3578 58.1331 104.1220 115.83100 58.1224 73.42210 #> V W X Y Z #> AFFX-MurIL2_at 146.8000 93.8829 103.85500 64.4340 175.61500 #> AFFX-MurIL10_at 85.0212 79.2998 71.65520 64.2369 78.70680 #> AFFX-MurIL4_at 31.1488 22.3420 19.01350 12.1686 17.37800 #> AFFX-MurFAS_at 12.8324 11.1390 7.55564 19.9849 8.96849 #> AFFX-BioB-5_at 90.2215 42.0053 57.57380 44.8216 61.70440 #> AFFX-BioB-M_at 64.6066 40.3068 41.82090 46.1087 49.41220 ``` --- ## SummarizedExperiment This is a more common structure related to modern experiments with different technologies .center[] --- ## An Example ```r library(SummarizedExperiment) data(airway, package="airway") se <- airway se ``` ``` #> class: RangedSummarizedExperiment #> dim: 64102 8 #> metadata(1): '' #> assays(1): counts #> rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99 #> rowData names(0): #> colnames(8): SRR1039508 SRR1039509 ... SRR1039520 SRR1039521 #> colData names(9): SampleName cell ... Sample BioSample ``` --- ## An Example Count data from the scRNA-seq experiment ```r assay(se) ``` ``` #> SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 #> ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 #> ENSG00000000005 0 0 0 0 0 #> ENSG00000000419 467 515 621 365 587 #> ENSG00000000457 260 211 263 164 245 #> ENSG00000000460 60 55 40 35 78 #> ENSG00000000938 0 0 2 0 1 #> ENSG00000000971 3251 3679 6177 4252 6721 #> ENSG00000001036 1433 1062 1733 881 1424 #> ENSG00000001084 519 380 595 493 820 #> ENSG00000001167 394 236 464 175 658 #> ENSG00000001460 172 168 264 118 241 #> ENSG00000001461 2112 1867 5137 2657 2735 #> ENSG00000001497 524 488 638 357 676 #> ENSG00000001561 71 51 211 156 23 #> ENSG00000001617 555 394 905 415 727 #> ENSG00000001626 10 2 9 2 10 #> ENSG00000001629 1660 1251 2259 1079 2462 #> ENSG00000001630 59 54 66 23 84 #> ENSG00000001631 729 692 943 475 1034 #> ENSG00000002016 201 161 256 99 268 #> ENSG00000002079 3 0 3 1 4 #> ENSG00000002330 206 174 184 111 194 #> ENSG00000002549 1459 1294 1317 998 1451 #> ENSG00000002586 7507 7203 9501 6214 10973 #> ENSG00000002587 2 0 1 0 0 #> ENSG00000002726 0 0 1 0 0 #> ENSG00000002745 4 6 22 10 2 #> ENSG00000002746 151 139 117 65 90 #> ENSG00000002822 411 303 446 195 445 #> ENSG00000002834 6314 6364 7831 5809 6677 #> ENSG00000002919 234 246 298 211 217 #> ENSG00000002933 1254 1508 636 431 25 #> ENSG00000003056 1189 947 1266 693 1288 #> ENSG00000003096 550 315 557 171 519 #> ENSG00000003137 124 57 256 63 30 #> ENSG00000003147 0 0 0 1 1 #> ENSG00000003249 81 71 207 80 109 #> ENSG00000003393 769 723 791 540 1115 #> ENSG00000003400 98 59 133 72 58 #> ENSG00000003402 1424 2617 1742 2364 2342 #> ENSG00000003436 4373 4183 5794 3230 7344 #> ENSG00000003509 287 280 357 191 386 #> ENSG00000003756 2368 1748 2694 1327 2647 #> ENSG00000003987 17 25 25 29 20 #> ENSG00000003989 47 56 12 3 51 #> ENSG00000004059 1090 1306 1140 817 1334 #> ENSG00000004139 86 83 103 51 115 #> ENSG00000004142 1496 1545 1607 964 1754 #> 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#> ENSG00000168350 2 8 5 #> ENSG00000168356 4 2 8 #> ENSG00000168367 0 0 0 #> ENSG00000168374 8952 4577 4902 #> ENSG00000168379 0 0 0 #> ENSG00000168384 0 0 0 #> ENSG00000168385 18998 12038 11405 #> ENSG00000168386 2533 1663 1242 #> ENSG00000168389 43 5 5 #> ENSG00000168393 291 209 197 #> ENSG00000168394 661 488 494 #> ENSG00000168395 379 279 328 #> ENSG00000168397 1236 755 811 #> ENSG00000168398 4530 6928 1219 #> ENSG00000168404 106 67 79 #> ENSG00000168405 180 110 218 #> [ reached getOption("max.print") -- omitted 51603 rows ] ``` --- ## An Example Genomic ranges for each transcript ```r rowRanges(se) ``` ``` #> GRangesList object of length 64102: #> $ENSG00000000003 #> GRanges object with 17 ranges and 2 metadata columns: #> seqnames ranges strand | exon_id exon_name #> <Rle> <IRanges> <Rle> | <integer> <character> #> [1] X 99883667-99884983 - | 667145 ENSE00001459322 #> [2] X 99885756-99885863 - | 667146 ENSE00000868868 #> [3] X 99887482-99887565 - | 667147 ENSE00000401072 #> [4] X 99887538-99887565 - | 667148 ENSE00001849132 #> [5] X 99888402-99888536 - | 667149 ENSE00003554016 #> ... ... ... ... . ... ... #> [13] X 99890555-99890743 - | 667156 ENSE00003512331 #> [14] X 99891188-99891686 - | 667158 ENSE00001886883 #> [15] X 99891605-99891803 - | 667159 ENSE00001855382 #> [16] X 99891790-99892101 - | 667160 ENSE00001863395 #> [17] X 99894942-99894988 - | 667161 ENSE00001828996 #> ------- #> seqinfo: 722 sequences (1 circular) from an unspecified genome #> #> ... #> <64101 more elements> ``` --- ## An Example Phenotype data ```r colData(se) ``` ``` #> DataFrame with 8 rows and 9 columns #> SampleName cell dex albut Run avgLength #> <factor> <factor> <factor> <factor> <factor> <integer> #> SRR1039508 GSM1275862 N61311 untrt untrt SRR1039508 126 #> SRR1039509 GSM1275863 N61311 trt untrt SRR1039509 126 #> SRR1039512 GSM1275866 N052611 untrt untrt SRR1039512 126 #> SRR1039513 GSM1275867 N052611 trt untrt SRR1039513 87 #> SRR1039516 GSM1275870 N080611 untrt untrt SRR1039516 120 #> SRR1039517 GSM1275871 N080611 trt untrt SRR1039517 126 #> SRR1039520 GSM1275874 N061011 untrt untrt SRR1039520 101 #> SRR1039521 GSM1275875 N061011 trt untrt SRR1039521 98 #> Experiment Sample BioSample #> <factor> <factor> <factor> #> SRR1039508 SRX384345 SRS508568 SAMN02422669 #> SRR1039509 SRX384346 SRS508567 SAMN02422675 #> SRR1039512 SRX384349 SRS508571 SAMN02422678 #> SRR1039513 SRX384350 SRS508572 SAMN02422670 #> SRR1039516 SRX384353 SRS508575 SAMN02422682 #> SRR1039517 SRX384354 SRS508576 SAMN02422673 #> SRR1039520 SRX384357 SRS508579 SAMN02422683 #> SRR1039521 SRX384358 SRS508580 SAMN02422677 ``` --- ## An Example Experimental meta-data ```r metadata(se) ``` ``` #> [[1]] #> Experiment data #> Experimenter name: Himes BE #> Laboratory: NA #> Contact information: #> Title: RNA-Seq transcriptome profiling identifies CRISPLD2 as a glucocorticoid responsive gene that modulates cytokine function in airway smooth muscle cells. #> URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24926665 #> PMIDs: 24926665 #> #> Abstract: A 226 word abstract is available. Use 'abstract' method. ``` --- ## An Example Data subsetting .pull-left[ ```r se[1:5, 1:3] ``` ``` #> class: RangedSummarizedExperiment #> dim: 5 3 #> metadata(1): '' #> assays(1): counts #> rownames(5): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ENSG00000000419 #> ENSG00000000457 ENSG00000000460 #> rowData names(0): #> colnames(3): SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 #> colData names(9): SampleName cell ... Sample BioSample ``` ] .pull-right[ ```r se[,se$cell=='N61311'] ``` ``` #> class: RangedSummarizedExperiment #> dim: 64102 2 #> metadata(1): '' #> assays(1): counts #> rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99 #> rowData names(0): #> colnames(2): SRR1039508 SRR1039509 #> colData names(9): SampleName cell ... Sample BioSample ``` ] --- class: center, middle # Annotation --- ## biomaRt The `biomaRt` package allows access to many public annotation databases ```r library(biomaRt) ensemblDB <- useMart('ensembl') searchDatasets(mart=ensemblDB, pattern='Human') ``` ``` #> dataset description version #> 80 hsapiens_gene_ensembl Human genes (GRCh38.p13) GRCh38.p13 ``` -- ```r ensemblHuman <- useMart('ensembl', dataset='hsapiens_gene_ensembl') ``` --- ## Identifying attributes ```r searchAttributes(mart=ensemblHuman, pattern='affy') ``` ``` #> name description page #> 104 affy_hc_g110 AFFY HC G110 probe feature_page #> 105 affy_hg_focus AFFY HG Focus probe feature_page #> 106 affy_hg_u133a AFFY HG U133A probe feature_page #> 107 affy_hg_u133a_2 AFFY HG U133A 2 probe feature_page #> 108 affy_hg_u133b AFFY HG U133B probe feature_page #> 109 affy_hg_u133_plus_2 AFFY HG U133 Plus 2 probe feature_page #> 110 affy_hg_u95a AFFY HG U95A probe feature_page #> 111 affy_hg_u95av2 AFFY HG U95Av2 probe feature_page #> 112 affy_hg_u95b AFFY HG U95B probe feature_page #> 113 affy_hg_u95c AFFY HG U95C probe feature_page #> 114 affy_hg_u95d AFFY HG U95D probe feature_page #> 115 affy_hg_u95e AFFY HG U95E probe feature_page #> 116 affy_hta_2_0 AFFY HTA 2 0 probe feature_page #> 117 affy_huex_1_0_st_v2 AFFY HuEx 1 0 st v2 probe feature_page #> 118 affy_hugenefl AFFY HuGeneFL probe feature_page #> 119 affy_hugene_1_0_st_v1 AFFY HuGene 1 0 st v1 probe feature_page #> 120 affy_hugene_2_0_st_v1 AFFY HuGene 2 0 st v1 probe feature_page #> 121 affy_primeview AFFY PrimeView probe feature_page #> 122 affy_u133_x3p AFFY U133 X3P probe feature_page ``` --- ## Identifying attributes ```r searchAttributes(mart=ensemblHuman, pattern='hgnc') ``` ``` #> name description page #> 63 hgnc_id HGNC ID feature_page #> 64 hgnc_symbol HGNC symbol feature_page #> 94 hgnc_trans_name Transcript name ID feature_page ``` --- ## Annotating probsets We first grab some probesets from the `sample.ExpressionSet` Affy experiment ```r affyIDs <- rownames(featureData(sample.ExpressionSet)) ``` Now let's find annotation ```r getBM(attributes = c('affy_hg_u95av2','hgnc_symbol'), filters = 'affy_hg_u95av2', values = affyIDs[200:203], mart = ensemblHuman) ``` ``` #> affy_hg_u95av2 hgnc_symbol #> 1 31439_f_at RHD #> 2 31439_f_at RHCE #> 3 31440_at TCF7 ``` --- class:middle, center # A RNA-seq pipeline --- ## The workflow + Exploratory data analysis + Differential expression analysis with [DESeq2](https://bioconductor.org/packages/DESeq2) + Visualization + We will start after reads have been aligned to a reference genome and reads overlapping known genes have been counted #### The experiment + In the experiment, four primary human airway smooth muscle cell lines were treated with 1 micromolar dexamethasone for 18 hours. + For each of the four cell lines, we have a treated and an untreated sample. --- ## Get data ```r # BiocManager::install('airway') library(airway) data(airway) se <- airway head(assay(airway)) ``` ``` #> SRR1039508 SRR1039509 SRR1039512 SRR1039513 SRR1039516 #> ENSG00000000003 679 448 873 408 1138 #> ENSG00000000005 0 0 0 0 0 #> ENSG00000000419 467 515 621 365 587 #> ENSG00000000457 260 211 263 164 245 #> ENSG00000000460 60 55 40 35 78 #> ENSG00000000938 0 0 2 0 1 #> SRR1039517 SRR1039520 SRR1039521 #> ENSG00000000003 1047 770 572 #> ENSG00000000005 0 0 0 #> ENSG00000000419 799 417 508 #> ENSG00000000457 331 233 229 #> ENSG00000000460 63 76 60 #> ENSG00000000938 0 0 0 ``` --- ## Create a DESeqDataSet ```r # BiocManager::install('DESeq2') library("DESeq2") dds <- DESeqDataSet(se, design = ~ cell + dex) dds ``` ``` #> class: DESeqDataSet #> dim: 64102 8 #> metadata(2): '' version #> assays(1): counts #> rownames(64102): ENSG00000000003 ENSG00000000005 ... LRG_98 LRG_99 #> rowData names(0): #> colnames(8): SRR1039508 SRR1039509 ... SRR1039520 SRR1039521 #> colData names(9): SampleName cell ... Sample BioSample ``` --- ## Run differential expression pipeline ```r dds <- DESeq(dds) ``` ``` #> estimating size factors ``` ``` #> estimating dispersions ``` ``` #> gene-wise dispersion estimates ``` ``` #> mean-dispersion relationship ``` ``` #> final dispersion estimates ``` ``` #> fitting model and testing ``` --- ## Run differential expression pipeline ```r (res <- results(dds)) ``` ``` #> log2 fold change (MLE): dex untrt vs trt #> Wald test p-value: dex untrt vs trt #> DataFrame with 64102 rows and 6 columns #> baseMean log2FoldChange lfcSE #> <numeric> <numeric> <numeric> #> ENSG00000000003 708.602169691234 0.381253982523051 0.100654411865818 #> ENSG00000000005 0 NA NA #> ENSG00000000419 520.297900552084 -0.206812601085049 0.112218646507257 #> ENSG00000000457 237.163036796015 -0.0379204312050853 0.143444654934093 #> ENSG00000000460 57.9326331250967 0.0881681758701333 0.287141822937771 #> ... ... ... ... #> LRG_94 0 NA NA #> LRG_96 0 NA NA #> LRG_97 0 NA NA #> LRG_98 0 NA NA #> LRG_99 0 NA NA #> stat pvalue padj #> <numeric> <numeric> <numeric> #> ENSG00000000003 3.78775232457072 0.000152016273044868 0.00128362968171095 #> ENSG00000000005 NA NA NA #> ENSG00000000419 -1.84294328546971 0.0653372915097682 0.196546085656283 #> ENSG00000000457 -0.26435583272523 0.791505741608343 0.911459479594897 #> ENSG00000000460 0.307054454722331 0.758801923982932 0.895032784975418 #> ... ... ... ... #> LRG_94 NA NA NA #> LRG_96 NA NA NA #> LRG_97 NA NA NA #> LRG_98 NA NA NA #> LRG_99 NA NA NA ``` --- ## Summarizing results ```r library(tidyverse) as.data.frame(res) %>% rownames_to_column(var = 'ID') %>% filter(padj < 0.1) %>% arrange(desc(abs(log2FoldChange))) %>% head() ``` ``` #> ID baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue #> 1 ENSG00000179593 67.243048 -9.505975 1.0545032 -9.014647 1.975049e-19 #> 2 ENSG00000109906 385.071029 -7.352626 0.5363887 -13.707645 9.137621e-43 #> 3 ENSG00000250978 56.318194 -6.327383 0.6777973 -9.335214 1.007876e-20 #> 4 ENSG00000132518 5.654654 -5.885114 1.3240439 -4.444803 8.797262e-06 #> 5 ENSG00000128285 6.624741 5.325904 1.2578147 4.234251 2.293144e-05 #> 6 ENSG00000127954 286.384119 -5.207158 0.4930818 -10.560435 4.545484e-26 #> padj #> 1 1.253739e-17 #> 2 2.256617e-40 #> 3 7.210311e-19 #> 4 1.000612e-04 #> 5 2.380012e-04 #> 6 5.058395e-24 ``` --- ## A visualization ```r topGene <- rownames(res)[which.min(res$padj)] dat <- plotCounts(dds, gene=topGene, intgroup=c("dex"), returnData=TRUE) ggplot(dat, aes(x = dex, y = count, fill=dex))+ geom_dotplot(binaxis='y', stackdir='center')+ scale_y_log10() ``` <!-- --> --- class:middle,center # A Seurat pipeline --- ## Grab the data and convert for Seurat ```r library(TENxPBMCData) library(Seurat) pbmc_3k <- TENxPBMCData(dataset='pbmc3k') colnames(pbmc_3k) <- paste0('Cell', seq_len(ncol(pbmc_3k))) pbmc <- CreateSeuratObject( counts=assay(pbmc_3k, 'counts'), project='pbmc3k', min.cells=3, min.features = 200) pbmc ``` ``` #> An object of class Seurat #> 13714 features across 2700 samples within 1 assay #> Active assay: RNA (13714 features, 0 variable features) ``` --- ## A bit of QC ```r # The [[ operator can add columns to object metadata. This is a great place to stash QC stats rownames(pbmc@assays$RNA@counts) <- r2 rownames(pbmc[['RNA']]@meta.features) <- r2 rownames(pbmc@assays$RNA@data) <- r2 # Change to gene names from Ensembl pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-") # percentage in mitochondria genome head(pbmc@meta.data) ``` ``` #> orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA percent.mt #> Cell1 pbmc3k 2419 779 3.0177759 #> Cell2 pbmc3k 4903 1352 3.7935958 #> Cell3 pbmc3k 3147 1129 0.8897363 #> Cell4 pbmc3k 2639 960 1.7430845 #> Cell5 pbmc3k 980 521 1.2244898 #> Cell6 pbmc3k 2163 781 1.6643551 ``` > See how analyses results are added to the same container. The idea is to keep all the experimental information together. This was a philosophic choice maide by the Bioconductor developers, inspired by the MIAME requirements and how data are stored on genomics databases like GEO --- ## Visualization ```r # Visualize QC metrics as a violin plot (plt <- VlnPlot(pbmc, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)) ``` <!-- --> --- ## Normalization ```r pbmc <- NormalizeData(pbmc) ``` > Note, we're saving in the same object --- ## Feature selection ```r rownames(pbmc[['RNA']]@meta.features) <- r2 pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000) # Identify the 10 most highly variable genes top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10) # plot variable features with and without labels plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc) plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE) CombinePlots(plots = list(plot1, plot2)) ``` <!-- --> --- ## PCA ```r pbmc <- ScaleData(pbmc) pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc)) print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5) ``` ``` #> PC_ 1 #> Positive: MALAT1, LTB, IL32, CD2, ACAP1 #> Negative: CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL #> PC_ 2 #> Positive: CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DRA #> Negative: NKG7, PRF1, CST7, GZMA, GZMB #> PC_ 3 #> Positive: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 #> Negative: PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 #> PC_ 4 #> Positive: HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HIST1H2AC, HLA-DQB1 #> Negative: VIM, S100A8, S100A6, S100A4, S100A9 #> PC_ 5 #> Positive: GZMB, FGFBP2, NKG7, GNLY, PRF1 #> Negative: LTB, VIM, AQP3, PPA1, MAL ``` > Important to note that each step just adds elements to the Seurat object --- ## PCA ```r DimPlot(pbmc, reduction = "pca") ``` <!-- --> --- ## t-SNE ```r pbmc <- RunTSNE(pbmc, dims=1:10) DimPlot(pbmc, reduction='tsne') ``` <!-- --> --- class:middle,center # Heatmaps --- ## Heatmaps There are several ways of doing heatmaps in R: + [http://sebastianraschka.com/Articles/heatmaps_in_r.html](http://sebastianraschka.com/Articles/heatmaps_in_r.html) + [https://plot.ly/r/heatmaps/](https://plot.ly/r/heatmaps/) + [http://moderndata.plot.ly/interactive-heat-maps-for-r/](http://moderndata.plot.ly/interactive-heat-maps-for-r/) + [http://www.siliconcreek.net/r/simple-heatmap-in-r-with-ggplot2](http://www.siliconcreek.net/r/simple-heatmap-in-r-with-ggplot2) + [https://rud.is/b/2016/02/14/making-faceted-heatmaps-with-ggplot2/](https://rud.is/b/2016/02/14/making-faceted-heatmaps-with-ggplot2/) --- ## Some example data ```r library(Biobase) data(sample.ExpressionSet) exdat <- sample.ExpressionSet library(limma) design1 <- model.matrix(~type, data=pData(exdat)) lm1 <- lmFit(exprs(exdat), design1) lm1 <- eBayes(lm1) # compute linear model for each probeset geneID <- rownames(topTable(lm1, coef=2, num=100, adjust='none',p.value=0.05)) exdat2 <- exdat[geneID,] # Keep features with p-values < 0.05 exdat2 ``` ``` #> ExpressionSet (storageMode: lockedEnvironment) #> assayData: 46 features, 26 samples #> element names: exprs, se.exprs #> protocolData: none #> phenoData #> sampleNames: A B ... Z (26 total) #> varLabels: sex type score #> varMetadata: labelDescription #> featureData: none #> experimentData: use 'experimentData(object)' #> Annotation: hgu95av2 ``` --- ```r # BiocManager::install('Heatplus') library(Heatplus) reg1 <- regHeatmap(exprs(exdat2), legend=2, col=heat.colors, breaks=-3:3) plot(reg1) ``` <!-- --> --- ```r library(Heatplus) reg1 <- regHeatmap(exprs(exdat2), legend=2, col=heat.colors, breaks=-3:3) plot(reg1) ``` <!-- --> --- ```r corrdist <- function(x) as.dist(1-cor(t(x))) hclust.avl <- function(x) hclust(x, method='average') reg2 <- regHeatmap(exprs(exdat2), legend=2, col=heat.colors, breaks=-3:3, dendrogram = list(clustfun=hclust.avl, distfun=corrdist)) plot(reg2) ``` <!-- --> --- ```r ann1 <- annHeatmap(exprs(exdat2), ann=pData(exdat2), col = heat.colors) plot(ann1) ``` <!-- --> --- ```r ann2 <- annHeatmap(exprs(exdat2), ann=pData(exdat2), col = heat.colors, cluster = list(cuth=7500, label=c('Control-like','Case-like'))) plot(ann2) ``` <!-- --> --- ```r # install.packages('d3heatmap') library(d3heatmap) d3heatmap(exprs(exdat2), distfun = corrdist, hclustfun = hclust.avl, scale='row') ``` [Link](../heatmap.html) Put your mouse over each point :) --- # Resources + [Organizing Single Cell Analysis with Bioconductor](https://osca.bioconductor.org/) + [Bioconductor Courses](https://bioconductor.org/help/course-materials/) + [2019 Bioconductor workshops](http://biocworkshops2019.bioconductor.org.s3-website-us-east-1.amazonaws.com/)